Il bicarbonato aumenta il pH del tumore e inibisce le metastasi spontanee.

Fonte: NCBI - PubMed (IN INGLESE).


Note: NaCO3 = Bicarbonato di Sodio.


Robey IF, Baggett BK, Kirkpatrick ND, Roe DJ, Dosescu J, Sloane BF, Hashim AI, DL Morse, Raghunand N, Gatenby RA, Gillies RJ.
Arizona Cancer Center, University of Arizona, Tucson, Arizona, USA.


Abstract:


Il pH esterno dei tumori solidi è acido come conseguenza di un metabolismo aumentato di glucosio e una scarsa perfusione. E' stato dimostrato che il  PH acido  stimola l'invasione delle cellule tumorali e le metastasi in vitro e cellulari prima della iniezione nella vena della coda in vivo. Il presente studio ha indagato se l'inibizione di questa acidità tumorale riduce l'incidenza di metastasi in vivo. Qui mostriamo che per via orale il NaHCO3 (3) ha selettivamente aumentato il pH dei tumori e ridotto la formazione di metastasi spontanee in cancro metastatico al seno nei topi. Questo regime di trattamento ha mostrato di aumentare significativamente il pH extracellulare, ma non il pH intracellulare, dei tumori (31) mediante la spettroscopia di risonanza magnetica P e l'esportazione di acido da tumori in crescita mediante microscopi a fluorescenza di tumori coltivati ​​in camere-finestra. (3) La terapia con  bicarbonato di sodio  ha anche ridotto il tasso di coinvolgimento linfonodale, ma non ha influenzato i livelli di cellule tumorali circolanti, suggerendo che le metastasi ridotte dell'organo non erano dovute ad un'aumentata invasività linfatica. Al contrario, la terapia con  bicarbonato di sodio (3) ha ridotto significativamente la formazione di metastasi epatiche dopo l'iniezione intrasplenica, suggerendo d'aver inibito lo stravaso e la colonizzazione. Nelle iniezioni in vena caudale di modelli alternativi di cancro, il bicarbonato ha avuto risultati misti, inibendo la formazione di metastasi da cellule tumorali  PC3M della prostata, ma non quelle di melanoma B16. Sebbene il meccanismo di questa terapia non sia noto con certezza, il pH basso ha dimostrato d'aumentare il rilascio di catepsina B attiva, un'importante  matrice che riconfigura la proteasi.




Effetto del NaHCO3 (Bicarbonato) sulle metastasi e la sopravvivenza. Cellule MDA-MB-231 sono state ottenute dalla American Type Culture Collection e mantenute in terreni di coltura (DMEM/F-12 supplementato con 10% FBS), a 37 ° C con 5% di CO2 in un'atmosfera umidificata. Queste cellule sono state stabilmente trasfettate con vettori di espressione per pcDNA3.1/LacZ (Invitrogen) igromicina-resistente. Queste cellule MDA-MB-231 con dicitura β-gal (10 milioni), sospese in 0,2 mL di soluzione fisiologica 0,8% sterile, sono state iniettate in sottocutanea nei  cuscinetti  di grasso mammari inguinali a sinistra di topi femmina  SCID  di 6 settimane. Si ha iniziato a somministrare ai topi (n = 8) acqua potabile (ad libitum) addizionata di NaHCO3 200 mmol / L (millimoli per litro, Nota del Traduttore) a 6 giorni dall'iniezione e mantenuta assieme agli animali non trattati (n = 8). Dopo 30 giorni di crescita del tumore primario, gli animali sono stati sacrificati e le lesioni polmonari β-gal positive sono state contate e misurate dopo la colorazione, come mostrato in A. Diametri medi della lesione (p <0,0001) e le frequenze (P = 0,0342) erano significativamente diverse tra i due gruppi come determinato dal test statistico a due rami affiancato alla correzione di Welch per variazioni ineguali. In una ripetizione di questo esperimento, 1 milione di cellule β-gal-MDA sono state iniettate in  cuscinetti grasso mammario inguinali, e  gli animali  di controllo (n = 9) e quelli bicarbonato-trattati (n = 15) sono stati mantenuti per 60 giorni prima del sacrificio. In questo esperimento, le immagini polmonari sono state analizzate utilizzando ImagePro Plus per determinare il peso del tumore metastatico contando il numero di  pixel  β-gal positive per animale. 
B, numero di lesioni polmonari per animale dopo 60 g di crescita in presenza di NaHCO3 nell'acqua potabile. La frequenza di lesioni per animale nei topi trattati con bicarbonato è stata confrontata con quella nei controlli non trattati da test t accoppiati (P = 0,0004). In un terzo esperimento, le cellule MDA-MB-231 sono state trasfettate stabilmente per esprimere  la pcDNA3/EGFP (proteina fluorescente verde intensificata, NdT) neomicina-resistente  (un dono di Peter Ratcliffe, Oxford University, Oxford, Regno Unito). Le cellule MDA-MB-231/eGFP (6,5 x 106) sono state iniettate nei cuscinetti lipidici inguinali  mammari di animali che sono stati randomizzati in gruppi di bicarbonato e di controllo (n = 12 per gruppo) 6 giorni dopo l'inoculazione. I tumori sono stati lasciati crescere per 5-6 settimane (ad un volume di circa 600 mmq), momento in cui sono state rimossi chirurgicamente. Laddove il cancro primario è ricresciuto (come nel caso in 9 su 24 animali), è stato asportato di nuovo. Gli animali sono stati monitorati bisettimanalmente e mantenuti con bicarbonato o acqua finché non hanno evidenziato una lesione linfonodale maggiore di 300 mmq di dimensioni, momento in cui essi sono stati sacrificati ed è stato eseguito l'esame necroscopico con un microscopio a dissezione con fluorescenza. I dati di questo esperimento sono rappresentati come una curva  di sopravvivenza di Kaplan-Meier (C). La differenza nella curva di sopravvivenza per gli animali trattati con bicarbonato rispetto a quelli sotto controllo è stata testata utilizzando il log-rank test (P = 0,027).


Metastasi al polmone non trattati, a sinistra, e trattati con bicarbonato, a destra (IN INGLESE)
Metastasi polmonari. Le immagini sono state ottenute al momento del sacrificio da singoli (numerati) topi in gruppi sotto controllo e sotto bicarbonato nell'esperimento mostrato in fig. 1C. Al momento della necroscopia, sono stati rilevati organo e metastasi linfonodali verdi fluorescenti tumorali provenienti da autopsie col Sistema Illumatool Bright Light (LT-9500) con un 470 nm nm/40 filtro di eccitazione (Lightools Research) e ripreso con un microscopio da dissezione Stereomaster 4 × (Fisher Scientific) con fotocamera digitale con DC290 Zoom (Eastman Kodak). Le immagini sono state catturate in uno stesso piano focale in presenza di 480-nm di eccitazione e emissione> 490-nm filtrata con un tempo di esposizione di 4 '' per immagini GFP e 1/10 '' per illuminazione di  luce  bianca. I dati di immagine sono stati analizzati con ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) segmentando il canale verde e contando pixel totali positivi per campo.
A, al momento del sacrificio, animali in esperimento sopravvivenza di fig. 1C sono stati sottoposti a necroscopia e le metastasi sono state quantificate mediante fluorescenza. Le immagini sono state catturate come descritto in Fig. 1C e la fluorescenza è stata quantificata seguendo la segmentazione RGB utilizzando il software di analisi ImageJ. Colonne, media densità di pixel di fluorescenza (intensità di fluorescenza × area) per linfonodi, organi viscerali, mesenterio e polmoni; barre orizzontali, SE. Auf, unità arbitrarie di fluorescenza. B, proteina fluorescente rosso-espressione della MDA-MB- 231 cellule tumorali sono state incubate a valori di pH basso e alto per 4 giorni, e quindi durante la notte in mezzi di 0,2% di siero, seguita da valutazione di attività della catepsina B pericellulare e intracellulare in cellule vive tramite "analisi in tempo reale", come descritto in Materiali e Metodi.
L'effetto del trattamento di NaHCO3 sul pH del tumore (IN INGLESE).
Tutte le misure in vivo sono state realizzate a 4.7 T su uno spettrometro di risonanza magnetica per immagini Biospec Bruker dotato di un G / cm 14 inserto auto schermato gradiente, con di eccitazione volume e bobine per la ricezione costruite in casa. La spettrografia dei tumori a risonanza magnetica 31P a immagine guidata e volume -selettivo in topi anestetizzati sono stati acquisiti come descritto in rif. 14. Il pHe e pHi sono stati misurati dagli spostamenti chimici di 3-aminopropylphosphonate esogena e fosfato inorganico endogeno, rispettivamente (17). Per la spettroscopia di tumori, 0,4 mL di 0,24 mol / L di 3 aminopropylphosphonate sono stati somministrati i. p. (immuno pprecipitazione, Nota della traduttrice) ai topi pochi minuti prima dell'anestesia. Dopo anestesia, un ulteriore 0,4 ml di 3-aminopropylphosphonate è stato iniettato i.p. (immuno pprecipitazione, Nota della traduttrice), e il topo preparato per 31P MRS come prima. Questa figura illustra la spettrografia a risonanza magnetica rappresentativa 31P dal eterotrapianti di tumori controllo (solido) e trattato con di NaHCO3 (tratteggiata) MDA-MB-231. di 3APP, 3-aminopropylphosphonate, Pi, endogeno fosfato inorganico, PME, fosfomonoesteri, NTP, nucleoside trifosfato. Incassati, colonne, i valori medi per pHi tumorale (P = 0,89) e pHe (P = 0,01) in assenza e presenza di trattamento di bicarbonato (n = 6 topi ciascuno); righe, SE. I dettagli dei parametri di acquisizione ed elaborazione sono forniti in Materiali e Metodi.

I tumori sono stati inoculati nella camera a finestra come descritto in Materiali e Metodi. phe è stato misurato dopo l'iniezione di acido libero da SNARF-1 per mezzo dell'eccitazione con un elio Ne laser a 543 nm ed emissioni sono state raccolte nel canale 1 con una banda passante 595/50-nm e nel canale 2 con filtro passante 640 nm di lunghezza . Immagini confocali sono state convertite in formato tif con ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/);. Rispettive immagini di sfondo state sottratte da ogni immagine di fluorescenza (canale rosso, blu, canale), e l'immagine è stata poi lisciata con una × 2 2 kernel. Le due immagini sono state poi divise, quindi la rimozione zero e non-un-numero (NaN), creando un'immagine raziometrica. Il pH di calibrazione in vitro è stato quindi applicato ad ogni pixel nell'immagine raziometrica. Regioni di interesse sono state elaborate intorno al tumore, la regione peritumorale prossimale, e la regione distale"normale", e il PHE medio è stato calcolato in queste regioni. La distribuzione del pH spaziale è stata calcolata tracciando un profilo di intensità (5 pixel) dal centro del tumore verso il bordo della camera a finestra. Questi profili sono stati disegnati in quattro direzioni ortogonali radiali, provenienti dal centroide del tumore. I profili di pH sono stati quindi allineati in modo che coincidessero al margine tumore, utilizzando l'immagine GFP per determinare il bordo del tumore. Immagini Phe rappresentative sono mostrate per topi non trattati (A) e trattati con bicarbonato (B) (10 × campo di vista, 12,5 mm). Le linee rosse, regione di interesse del tumore, definite da immagini GFP, mostrato in Fig. supplementare. S2. C, si sono concentrate nell'immagine confocale del del tumore (bianco) circondato da una rete microvascolare marcata (verde). Le linee radiali, le direzioni lungo le quali sono stati misurati valori di Phe. D, dei minimi quadrati in tutte le direzioni e tutti i tumori che mostrino la distribuzione phe lungo le linee radialiper i tumori trattati con bicarbonato e sotto controllo. "0" è baricentro di tumore, e la linea verticale indica bordo di del tumore.

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